Введение
Постоянный рост интенсивности электромагнитных излучений техногенных источников ставит вопрос об их глобальном многостороннем действии на организм человека. При этом, как правило, имеют ввиду электромагнитное загрязнение окружающей среды, воздействие на организм человека фоновых электромагнитных излучений высоковольтных линий электропередач, теле- и радиостанций, средств информатизации и связи, медицинской электроаппаратуры [1]. Многочисленные данные по изучению функционального статуса системы лимфоцитов, основной в клеточном отношении клеточной популяции периферической крови, являются основанием для изучения влияния ионизирующих излучений на данные клетки [2-7]. Так, авторы статьи [3] отмечают, что способность лимфоцитов периферической крови облученных лиц к адаптивному ответу в отдаленные сроки после облучения позволяют рассматривать их в качестве биологического маркера функционального состояния пула стволовых кроветворных клеток.
Однонитевые разрывы (ОР) в молекуле ДНК являются самым многочисленным типом повреждения, наряду с двунитевыми разрывами они возникают либо при физиологических условиях в лимфоцитах, либо при патологических процессах [4], окислительном стрессе [7] или действии ионизирующего излучения [5]. Авторами работы [4] исследованы уровни разрывов ДНК до и после облучения лимфоцитов in vitro в дозе 1 Гр, показана чувствительность лимфоцитов периферической крови летчиков и космонавтов к воздействию излучения. Обследованы 17 доноров, 41 летчик и 8 космонавтов. В работе [8] подытоживаются результаты исследований через 5,10 и 24 года после аварии на ЧАЭС. Через 24 года после аварии были обследованы ликвидаторы и обнаружено, что в лимфоцитах крови повышена частота клеток с аберрациями хромосомного типа, достоверно выше уровень одно- и двунитевых разрывов ДНК. ОР репарируются по негомологичным концам ДНК на всех этапах клеточного цикла. Они сопровождают действие очень многих агентов и являются вторичными, промежуточными дефектами при репарации. Такая "вездесущность" ОР ДНК сочетается с устойчивым представлением об их нелетальности [9]. В то же время ОР способны индуцировать апоптоз в ряде клеток [10-11].
Известно, что наночастицы (НЧ) серебра являются прекрасным обеззараживающим препаратом, уничтожающим болезнетворные микроорганизмы, но по поводу токсичности НЧ серебра мнения авторов расходятся. Так, в работе [12], описывается применение НЧ серебра как средство против кишечной палочки. Наночастицы накапливаются в мембранах клеток бактерий, создавая в них разрывы, разрушающие клетку. При этом авторы указывают на нетоксичность данных наноматериалов, которые могут быть пригодны для разработки новых видов бактерицидных материалов. Однако в статье [13], подтверждающей бактерицидные свойства НЧ серебра, автор упоминает, что работы, направленные на количественную оценку биологического действия НЧ серебра на человека и животных, практически отсутствуют. Многие НЧ способны оказывать крайне негативное влияние на живые системы и вызвать необратимые изменения в организме.
Целью данной работы являлось исследование зависимости количества однонитевых разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека от воздействия различных видов ионизирующего излучения: гамма-, СВЧ- и лазерного излучений, а также при инкубировании лимфоцитов в среде, содержащей наночастицы серебра.
Материалы и методы
Объектом исследований были лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Выделение чистой взвеси лимфоцитов из донорской крови проводили в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл), как описано в работе [5]. Лимфоциты троекратно отмывались и инкубировались в физиологическом растворе. После соответствующих облучений клетки лизировали 4,5 М раствором мочевины в течение 10 мин при температуре 24 °С. После щелочной обработки лизатов и добавления интеркалирующего агента - бромистого этидия измеряли интенсивность флюоресценции полученных образцов в кварцевой кювете на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi F-2700 при длине волны возбуждения – 540 нм и λпогл 610 ± 5 нм. Количество ОР ДНК оценивали по отношению величин флюоресценции контрольных и экспериментальных образцов. Результаты представляли в виде процентного соотношения количества щелочнолабильных сайтов ДНК, содержащих ОР, к общему количеству ДНК. Для определения концентрации и верификации лимфоцитов в рабочем образце цельной крови и взвеси использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М».
Для изучения влияния СВЧ-излучения на содержание ОР ДНК были использованы СВЧ генераторы: ГКЧ 53, Р2-68, Р2 69 мощностью 3 мВт. Образцы подвергались воздействию излучения в течение 10 минут при разных частотах. При изучении влияния гамма-излучения на содержание ОР ДНК в лимфоцитах был использован радиоактивный препарат 137Cs с активностью 0,104 МБк. Образцы лимфоцитарной взвеси облучались в течение различных периодов времени. Также образцы взвеси лимфоцитов обрабатывались импульсным газоразрядным лазером на парах меди (ЛПМ) с длинами волн генерации 510,6 и 578,2 нм. В ряде экспериментов лимфоциты инкубировали в физрастворе, содержащем наночастицы серебра. Использовали водный раствор наночастиц серебра (диаметр 12 нм ± 10%) с исходной концентрацией 630 мкг/ мл. Раствор содержал в качестве стабилизатора поливинилпиролидон. Размеры наночастиц серебра контролировались с помощью электронного растрового микроскопа JEONJSM 7500F
Лабораторное диагностическое обследование выполнено в соответствии с обязательным соблюдением этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 г. с дополнениями 1983 года. Полученные данные анализировали в пакете статистического анализа Statistica 6.0. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [14].
Результаты и обсуждения
Выделенная взвесь лимфоцитов периферической крови здоровых доноров обрабатывалась гамма-излучением препарата 137Cs активностью 0,104 МБк в течение 30, 60 и 90 минут. После соответствующей обработки, были сняты спектры флуоресценции лизатов лимфоцитов с бромистым этидием, при этом спектральный диапазон регистрации составлял 500-740 нм (рис.1).
Рисунок 1. Интенсивность флюоресценции раствора бромистого этидия в растворе лизатов лимфоцитов крови, обработанных гамма-излучением 137Cs с активностью 0,104 МБк в течение 30 минут (О1), 60 минут (О2), 90 минут (О3).
В лимфоцитах при воздействии гамма-излучения 137Cs наблюдалось увеличение количества ОР ДНК при увеличении времени облучения: в течение 30 минут на 44,3 ± 0,4 %, 60 минут на 56,5 ± 0,9 %, 90 минут на 68,3 ± 0,8 % больше, чем в контрольном образце (рис. 2).
Рисунок 2. Количество ОР ДНК лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, после воздействия на них гамма-излучением 137Cs с активностью 0,104 МБк при разном времени облучения.
Известно применение ионизирующего излучения в клинической медицине – это контактная или дистанционная лучевая терапия. Возможность облучать глубоко расположенные опухоли рентгеновскими лучами крайне ограничена, поскольку максимум дозы приходится на поверхность тела, именно поэтому в онкологии широко используется гамма-излучение 60Co, Е=1,17 кэВ или тормозное гамма-излучение Е=25 МэВ. Вместе с тем возникает проблема вынужденного облучения здоровых тканей, лежащих за опухолью [16]. Первым и основным механизмом, вызывающим гибель клетки, является хромосомная аберрация – одиночный или двойной разрыв нитей спирали ДНК в месте акта ионизации под воздействием ионизирующего излучения. Эти повреждения приводят к утрате наследственного механизма клетки ее гибели при первом и последующих митозах, а при многократных повреждениях иногда сразу, в интерфазе. Вторым механизмом, приводящим к гибели клетки, является ионизационное повреждение внутриклеточных мембран, на которой осуществляются сложные процессы клеточного метаболизма. И, наконец, важным следствием ионизирующего облучения является образование большого количества высокоактивных радикалов и перекисей, которые вызывают разрушение различных органелл клетки. В современной медицине используются аппараты прецизионной точности, воздействующие строго на опухоль. Тем не менее, негативные последствия такого лечения могут проявиться сразу или через некоторое время. Примером прибора, использующим ионизирующее излучение высокой частоты, является «Гамма-Нож», с помощью которого проводится точное локальное облучение различных труднодоступных опухолей образований головного мозга и области голова-шея. Гамма-Нож производства фирмы Elekta (Швеция), представляет собой аппарат с 192 источниками фотонов. Источником гамма-излучения является радионуклид 60Co с периодом полураспада — 5,271 года, суммарной исходной активностью — 5168 Ки (1,9×1014 Бк) и мощностью на момент загрузки установки не менее 3,3 Гр/мин.
Также было рассмотрено влияние СВЧ-излучения на появление однонитевых разрывов ДНК при облучении лимфоцитов на частотах 3,5 ГГц, 50 ГГц, 70 ГГц. Данные частоты выбраны не случайно, поскольку именно в этом диапазоне частот работают терапевтические устройства для лечения облучением миллиметрового диапазона, т.н. терапия крайне высокими частотами (КВЧ-терапия), применяемая, в частности, для лечения онкологических (совместно с традиционными методами) заболеваний. Примером такого прибора может служить терапевтическая установка „ЯВЬ-1" с рабочей длиной волны 5,60 мм (частота 53534 ± 10 МГц) и плотностью мощности облучения на раскрыве рупора — не менее 10 мВт/кв. см. Лимфоциты, выделенные из крови, облучались СВЧ-излучением в течение 10 минут на частотах 3,5 ГГц, 50 ГГц, 70 ГГц при мощности 3 мВт. На рис. 3 приведено количество ОР ДНК лимфоцитов после их обработки СВЧ-излучением.
Рисунок 3. Количество ОР ДНК лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, после воздействия СВЧ-излучением при разных частотах. Время облучения - 10 минут.
Видно, что с увеличением частоты количество ОР ДНК в лимфоцитах также увеличивается: при воздействии на них СВЧ-излучением с частотой 3,5 ГГц на 32,3 ± 0,9 %, с частотой 50 ГГц на 40,1 ± 1,1 %, с частотой 70 ГГц на 49,8 ± 0,7 % по сравнению с контрольным образцом.
В отечественных санитарных правилах нормирование электромагнитных полей производится отдельно для производственного персонала и населения. Учитывается, что производственный персонал может попадать в электромагнитное поле только в течение рабочей смены на производстве и подлежит периодическим медицинским обследованиям и оценке влияния неблагоприятного производственного фактора. В то же время, влияние электромагнитных полей от базовых станций и бытовых приборов происходит круглосуточно и постоянно, а диапазон состояний организма у населения (от ребенка до пожилого человека, от здорового до тяжелобольного) значительно шире, чем у производственного персонала.
Известно применение в медицине лазера на парах меди (ЛПМ). Так, модель ЛПМ "Кулон-10-М" с длинами волн генерации 510,6 и 578,2 нм используется в многофункциональной лазерной медицинской установке "КУЛОН-Мед" [15]. Нами изучалось влияние излучения данного лазера на структурные повреждения молекул ДНК лимфоцитов. Взвесь лимфоцитов обрабатывалась импульсным газоразрядным лазером на парах меди. Образцы облучались при длинах волн 578,2 и 510,6 нм в течение 3 и 5 минут при средней мощности около 10 Вт, результаты исследований приведены на рис.4.
Рисунок 4. Количество ОР ДНК лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, после воздействия на них лазерного излучения. Примечание. * – p<0,05 в сравнении с контролем (1). Количество ОР ДНК лимфоцитов изучено при воздействии на них лазерного излучения длиной волны 510,6 нм (2) и 578,2 нм (3) в течение 3 и 5 мин.
Наблюдается увеличение количества ОР ДНК после облучения лазером при длине волны 510,6 нм на 18,1 ± 0,7 % (время облучения 3 мин) и на 6,1 ± 0,5 % (время облучения 5 мин), при длине волны 578,2 нм на 18,1 ± 0,7 % (время облучения 3 мин) и на 22,3 ± 0,9 % (время облучения 5 мин). Из рис.4. видно, что при длине волны генерации 578,2 нм в лимфоцитах образуется меньше ОР ДНК, чем при длине волны генерации 510,6 нм. При увеличении времени воздействия с 3 до 5 мин количество ОР ДНК лимфоцитов увеличивается в среднем в 2 – 2,5 раза.
Для изучения влияния НЧ серебра на содержание ОР ДНК лимфоцитов периферической крови in vitro, лимфоциты инкубировались в течение 60 мин в физрастворе с добавлением НЧ серебра в концентрациях: 1,863 мкг/л, 1,242 мкг/л, 0,621 мкг/л. Результаты экспериментов показали увеличение количества ОР ДНК лимфоцитов по сравнению с контрольными образцами в среднем на 26,8 ± 2,7 % (n=20), причем количество ОР ДНК практически не зависело от концентрации наночастиц серебра в физрастворе для данного диапазона. Отмечается [12], что наночастицы серебра с размерами меньше 100 нм хотя бы по одному измерению обладают возможностью создавать активные формы кислорода.
Заключения и выводы
При проведении исследований было показано, что деструктивное действие гамма-излучения на ДНК лимфоцитов увеличивается со временем экспозиции, поэтому использование его в медицинских целях должно быть максимально локальным, а время воздействия лучевой терапии не превышать необходимого минимума, чтобы не повреждать здоровые ткани, лежащие за опухолью.
Показано, что СВЧ-излучение воздействует на молекулы ДНК лимфоцитов, увеличивая количество однонитевых разрывов. Поскольку эффект возрастает с увеличением частоты, можно предположить, что использование в КВЧ-терапии, по возможности, более низких частот, будет увеличивать сохранность иммунокомпетентных клеток крови.
Измерения количества ОР ДНК после инкубирации лимфоцитов в физрастворе, содержащем НЧ серебра, показали, что в изученном диапазоне концентраций (1,863-0,621 мкг/л) НЧ серебра диаметром 12 нм ± 10% разрушают молекулу ДНК. Наночастицы с размерами менее 10 нм могут проникать сквозь клеточную мембрану и накапливаться в клетке, вызывая тем самым изменения ее функций. Оценка количества ОР ДНК лимфоцитов может служить одним из факторов применимости НЧ серебра в быту, для лекарственных средств, в медицинских целях.
Таким образом, на основании вышеприведенных данных, можно предположить, что определение количества однонитевых разрывов ДНК в иммунокомпетентных клетках может стать инструментом для исследования воздействия физических факторов в целом и ионизирующих излучений, в частности, на живой организм.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ р_а № 16-42-230187.
1. Пряхин Е. А. Электромагнитные поля и биологические системы: стресс и адаптация / Е. А. Пряхин, А. В. Аклеев. — Челябинск: Полиграф-Мастер, 2011. – 239 с.
2. Авдеева М. Г. Виды иммунокомпетентных клеток и их функции / М. Г. Авдеева, М. Г. Шубич // Иммунология. — 2006. — №7. — С. 824–829.
3. Аклеев А. В. Адаптивный ответ лимфоцитов как индикатор состояния гемопоэза у облученных лиц / А. В. Аклеев, А.В. Алещенко, О.В. Кудряшова, Л.П. Семенова, А.М. Серебряный, О.И. Худякова, И.И. Пелевина // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2011. — Т. 51. № 6 . — С. 645–651.
4. Воробьева Н.Ю. Чувствительность лимфоцитов периферической крови летчиков и космонавтов к воздействию излучения: индукция двунитевых разрывов ДНК / Н.Ю. Воробьева , А.Н. Осипов , И.И. Пелевина // Бюл. эксп. биол. и медицины. — 2007. — Т. 144. № 10. — С. 404— 407.
5. Текуцкая Е.Е. Исследование воздействия электромагнитного излучения низкой частоты на активность лимфоцитов / Е.Е. Текуцкая, Ю.А. Васильев, А.А. Храмцова // Российский иммунологический журнал. — 2014. — Т.8(17), №3. — С. 466–469.
6. Текуцкая Е.Е. Влияние внешних факторов на повреждение и репарацию ДНК лимфоцитов периферической крови человека / Е.Е. Текуцкая, Р.В. Василиади, А.А. Храмцова // Российский иммунологический журнал. — 2015. — Т.9 (18), №3 (1). — C. 223 — 225.
7. Tekutskaya E.E. The Effect of a Low Frequency Electromagnetic Field on DNA Molecules in Aqueous Solutions / E.E. Tekutskaya, M.G. Barishev, G.P. Ilchenko // Biophysics. — 2015. — V. 60, No. 6. — pp. 913–916.
8. Серебряный А.М. Нарушение связей между иммунным статусом и окислительным гомеостазом в лимфоцитах крови ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС / А.М. Серебряный, А.В. Алещенко, О.В. Кудряшова // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2012. — Т. 52. № 4 .— С. 341-345.
9. Belyaev I.Y. Radiation-induced DNA repair foci: spatio-temporal aspects of formation, application for assessment of radiosensitivity and biological dosimetry / I.Y. Belyaev // Mutat. Res. – 2010. – V. 704, № 1-3. – P. 132–141.
10. Jackson S.P. The DNA-damage response in human biology and disease / S.P. Jackson, I. Bartck // Nature. – 2009. – V.461, №7267 – P.1071–1078.
11. Кухта В.К. Молекулярные механизмы апоптоза / В.К. Кухта, Н.В. Морозкина, Е.В. Богатырева // Биомедицинский журнал. – 2004. – № 1. – С. 1–8.
12. Sondi I., Salopek-Sondi B. J. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria / I. Sondi, B.J. Salopek-Sondi // Colloid. Interface Sci. – 2004 – Vol. 177. – P. 82.
13. Крутиков Ю. А. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы / Ю.А. Крутиков, А.А. Кудринский, А.Ю. Олейник // Успехи химии. – 2008. – Т. 77, № 3. – С. 242–269.
14. Герасимов А.Н. Медицинская статистика / А.Н. Герасимов — М: ООО Медицинское информационное агентство, 2007. – 480 с.
15. Ключарева С.В. Лазерные технологии при лечении сосудистых дефектов кожи / С.В. Ключарева, И.В. Пономарев // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. – 2005. – № 1. – С. 47 – 52
16. Ярмоненко С.П. Жизнь, рак и радиация / С.П. Ярмоненко. — М: Изд-во АТ, 1993. – 320с
Поступила в редакцию 28 июня 2017 г., Принята в печать 20 июля 2017 г.
