Введение

Исследования действия низкочастотного электромагнитного поля (ЭМП) и тяжелых металлов на денатурационные и конформационные переходы ДНК и триптофансодержащих белков во многом мотивированы задачей  скрининга ДНК-повреждающих факторов. Данная тематика актуальна и для фундаментальной биофизики, медицины и биотехнологии, поскольку эффективность функционирования белков контролируется структурным состоянием макромолекулы: ее конформацией и внутримолекулярной динамикой.

Изучение влияния тяжёлых металлов на флуоресцентные характеристики природных биополимеров, в частности, альбуминов, обусловлены также важностью темы создания новых эффективных методов диагностики процесса агрегации белков, которые активизируются при наличии тяжёлых металлов в среде [1, 2]. Сывороточный альбумин, помимо поддержания осмотического давления крови и белкового резерва организма, выполняет важную функцию, осуществляя транспорт эндогенных и экзогенных субстанций [3]. Авторами [4, 5] при проведении исследований сыворотки крови белых крыс флуоресцентным методом показано, что поступление в организм избыточных концентраций ионов тяжелых металлов приводит к блокированию или аллостерическим изменениям центров связывания альбумина. В работе [3] методом спин-резонансной спектроскопии изучено связывание ионов тяжелых металлов с молекулами сывороточного альбумина человека и бычьего сывороточного альбумина, а также описаны чипы биосенсоров на основе альбумина для определения металлов.

В статьях [3, 6] обсуждаются экспериментальные данные, полученные при изучении влияния низкочастотного ЭМП на денатурационные и конформационные изменения человеческого сывороточного альбумина (HSA) с помощью анализа собственной и индуцированной флуоресценции в контексте его роли в транспорте лекарственных веществ и механизмов регуляции связывания лигандов и диссоциации лиганд-альбуминового комплекса. Сделан вывод об уровне сохранения нативной конформации белков плазмы крови и, следовательно, о сохранности их функциональных свойств при воздействии на плазму крови человека низкоинтенсивного низкочастотного ЭМП.

Одним из наиболее опасных токсических факторов, способным оказывать мембрано-, ферменто-, генотоксическое воздействия, является кадмий (Cd²⁺), который значительно влияет на обмен нуклеиновых кислот и белка, обладает высокой кумулятивной способностью, проявляя сродство к клеточным структурам почек, печени и сердца [1]. Ионы кадмия, накапливаясь в митохондриях, лизосомах и ядре, вызывают их ультраструктурные изменения, взаимодействуют с сульфгидрильные группами белков, снижая скорость метаболических процессов, вызывая гипоэнергетическое состояние клетки, нарушая углеводный обмен и синтез гликогена в печени [1]. Известно, что локальные загрязнения сточными водами горно-металлургических комбинатов, производств красителей, никель-кадмиевых аккумуляторов, минеральных удобрений возможны даже после специальной очистки, поскольку содержат значительные количества солей кадмия, в связи с чем, попадание и накопление ионов Cd²⁺ в организме человека представляет серьезную медико-экологическую проблему [7].

Особый интерес при исследовании влияния ЭМП на живые системы привлекают биополимеры на основе нуклеиновых кислот. Авторами работы [8] установлено, что в молекуле ДНК возможен перенос заряда на большие расстояния, а также испускание фотонов при возбуждении или после возбуждения молекулы ДНК. Низкочастотное ЭМП используется для изменения скорости ряда важных биохимических процессов: репарации отдельных участков ДНК с выделенными соматическими мутациями; генерации активных форм кислорода нейтрофилами; изменения уровня содержания циклотронов и др. [9-11]. Известными проявлениями стресс-реакции в клетках являются повреждения биологически значимых молекул и, прежде всего, ДНК. В статье [10] высказано предположение, что изменение гидратной оболочки ДНК под действием низкочастотного ЭМП при некоторых параметрах ЭМП приводит к восстановлению водородных связей, образованию сшивок и в целом к репарации ДНК.

Целью настоящей работы явилось исследование влияния низкоинтенсивного электромагнитного поля в диапазоне частот  5 - 30 Гц и ионов кадмия Cd²⁺ на флуоресцентные характеристики водных растворов ДНК и HSA методом классической флуоресцентной спектроскопии и выявление происходящих при этом возможных денатурационных и конформационных переходов природных биополимеров. Совместное действие катионов кадмия и ЭМП может, как вызывать агрегацию молекул ДНК и HSA, так и непосредственно влиять на характеристики флуорофоров.

Материалы и методы

Объектом исследований были водные растворы ДНК и HSA. ДНК из собранных образцов крови у добровольцев (мужчины 21-25 лет, некурящие, n = 10), выделяли с помощью реактивов готовых коммерческих наборов АмплиСенс – «ДНК–сорб–В» (Москва) сорбционным способом. Подготовка образцов осуществлялась следующим образом: взятие крови проводилось в пластиковые пробирки объемом 2,5 мл с добавлением в качестве антикоагулянта динатриевой соли этилендиаминтетрацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Содержимое пробирки перемешивалось переворачиванием 2-3 раза, центрифугировалось при 3000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре (18-25°С). Отбиралась верхняя фракция и переносилась в отдельную пластиковую пробирку. Выделение ДНК из крови производилось в  стерильном ламинарном боксе «БАВп-01-Ламинар», оснащенном термостатом для пробирок типа «эппендорф», вакуумным отсасывателем для удаления надосадочной  жидкости и вортексом. После отбора необходимого материала для исследований, в пробирки вносился лизирующий раствор гуанидина. Отобранные и подготовленные описанным выше способом пробы подвергались тщательному ресуспензированию на вортексе для удаления фрагментов клеточных органелл и мембран. После чего во все пробы вносился сорбент универсальный по 25 мкл в каждую пробирку. Процедура ресуспензирования производилась несколько раз и сопровождалась последующим центрифугированием при 5000 об/мин. После этого надосадочная жидкость удалялась с помощью вакуумного отсасывателя.

Затем в пробы с сорбентом многократно и тщательно промывались, просушивались при  температуре 65°С в течение 5-10 минут. После этого в пробирки добавлялось по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Полученная жидкость ресуспензировалась на вортексе и просушивалась в термостате около 5 минут при температуре 65°С, снова центрифугировалась уже при 12000 об/мин в течение 1 минуты. После проделанных процедур надосадочная жидкость содержала очищенную ДНК, которая отделялась от осадка с помощью вакуумного отсасывателя и помещалась в отдельные пробирки. Концентрацию ДНК в конечном растворе определяли спектрофотометрически, нативность ДНК контролировалась по величине  коэффициента молярной экстинкции при длине волны 260 нм  Е_260нм. Данный метод выделения позволяет получить концентрацию ДНК в конечном растворе до 30 мкг/мл [11]. Все дальнейшие исследования проводились с разбавленными водными растворами ДНК с концентрацией, равной 2,5 мкг/мл.

В работе также использовался раствор HSA с концентрацией 5 мкМ и раствор ацетата кадмия Cd²⁺ с концентрациями от 0,5 мкг/мл. Для стабилизации раствора HSA образцы перед добавлением солей кадмия Cd²⁺ и измерениями хранились сутки и более при температуре 4° С. Для изменения значения pH растворителя применялись растворы соляной кислоты или гидроксида калия с малыми концентрациями.

Флуоресцентные исследования проводились на спектрофлуориметре Hitachi F-2700 (Япония) при комнатной температуре, равной 22 ^оС. Триптофановая флуоресценция водных растворов HSA регистрировалась в диапазоне 270 – 500 нм при возбуждении светом с длиной волны λ_возб = 295 нм, а растворов  ДНК в диапазоне 220 - 900 нм и длине волны возбуждения λ_возб = 320 нм.

Обработка проб электромагнитным полем. Обработку водных растворов ДНК и HSA ЭМП низкой частоты проводили в химически чистой стерильной пластиковой посуде при температуре 20–22°С и толщине облученного слоя 2 мм. В ходе экспериментов использовалось разработанное нами устройство для автоматизированного исследования биологических жидкостей в переменном магнитном поле, описанное в работах [12, 13]. Время обработки составляло 10 мин. Напряженность магнитной составляющей поля достигала 24 ± 4 А/м, частота изменялась с шагом  2 Гц от 5 до 30 Гц.

Полученные данные анализировали в пакете статистического анализа Statistica 6.0. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [14].

Результаты и обсуждение

Нуклеиновые кислоты, как и триптофансодержащие белки, относятся к природным флуорофорам, что позволяет изучать  их состояние в водных растворах с помощью флуоресцентной спектроскопии. В ходе проведенного эксперимента была подобрана длина волны возбуждения водного раствора ДНК, она составила 320 нм. На спектрах флуоресценции водных растворов ДНК при λ_возб = 320 нм наблюдаются два характерных пика с максимумами интенсивности флуоресценции 320±1 нм и 640±5 нм соответственно (рис. 1).

Рис. 1 Спектры флуоресценции водного раствора ДНК с концентрацией 2,5 мкг/мл после обработки ЭМП с частотами, Гц:  19 (1), 15 (2), 13 (3), 25 (4). Время обработки 10 мин,  λ_возб =320 нм, t =22 ^оС.

Наблюдаемый на спектрах флуоресценции растворов ДНК первый пик связан с наличием в составе молекул ДНК хромофоров, поглощающих УФ-излучение, - сопряженные π-связи азотистых оснований [15]. Полученный пик не совпадает с  максимумом интенсивности флуоресценции гуанина, как это указывается авторами [16]. При возбуждении водного раствора ДНК УФ- излучением с длиной волны 320 нм, наблюдали появление, кроме этой полосы флуоресценции, дополнительной полосы флуоресценции, обладающей длинноволновым сдвигом, с длиной волны 640 нм, возможно, данная полоса свечения возникла при окислении свободными радикалами азотистых оснований ДНК. Авторы в работе [17] относят пик с максимумом 635 нм на спектрах флуоресценции к появлению в растворе синглетного кислорода, так, говорится, что наличие пиков на длинах волн 535, 635 и 1270 нм позволяет утверждать, что в анализируемом растворе имеется синглетный кислород, который при переходе в основное триплетное состояние испускает фотоны света в данном диапазоне. Это согласуется с мнением, изложенным в работах [10, 11], в которых указывается, что одной из причин изменения хемилюминесценции водных растворов ДНК при действии на них ЭМП НЧ может быть образование активных форм кислорода в водном растворе. Об образовании двух- и однонитевых разрывов в растворе ДНК под действием как пероксирадикалов, так и низкочастотного ЭМП отмечается и авторами [9].

При воздействии ЭМП на водные растворы ДНК отмечалось незначительное возрастание площади первого пика при частотах обработки ЭМП 13 и 21-25 Гц по сравнению с контролем (рис. 2).  Площадь второго пика изменялась мало.

Рис. 2  Интенсивность флуоресценции I_max1 (при 320 нм) и I_max2 (при 640 нм) водного раствора ДНК с концентрацией 2,5 мкг/мл, обработанного ЭМП с частотами от 5 до 30 Гц, время обработки 10 мин,  λ_возб =320 нм, t =22 ^оС (n = 10, р = 0,95, t_0,95 = 1,96).

Добавление ионов кадмия в концентрациях выше ПДК (предельно допустимая концентрация) в раствор ДНК приводит к поэтапному увеличению интенсивности флуоресценции с увеличением концентрации кадмия (рис. 3), что говорит об отсутствии процесса денатурации ДНК, при которой происходило бы тушение флуоресценции. ПДК кадмия в цельной крови составляет по данным [13, 16] 0,007 мкг/мл. При соотношениях концентраций в растворе [Cd²⁺] / [ДНК] = 1:5; 1:2,5; 1:1 на зависимости интенсивности флуоресценции водного раствора ДНК от концентрации ионов Cd²⁺ в растворе наблюдаются несколько плато (рис. 3). Это свидетельствует о дискретном изменении структуры ДНК в присутствии ионов кадмия в растворе. Возможно встраивание ионов кадмия в двойную спираль ДНК в качестве интеркалирующего агента, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции.

Рис. 3 Зависимость интенсивности флуоресценции водного раствора ДНК (2,5 мкг/мл) от концентрации ионов Cd²⁺ в растворе. λ_возб =320 нм, t =22 ^оС (n = 5, р = 0,95, t_0,95 = 2,78).

Известно [1, 7] подобное сродство ДНК к эссенциальному микроэлементу Zn²⁺, входящего в состав ДНК-полимеразы, Близость  металлических  радиусов Cd²⁺ и  Zn²⁺ обусловленная косвенным влиянием лантаноидного сжатия, одинаковая степень окисления, способность образовывать комплексы с одинаковым координационным числом делает кадмий и цинк антагонистами во многих биохимических реакциях в организме. Именно нарушение обмена цинка лежит в основе угнетения синтеза ДНК в тканях плода, поступающего при нагрузке организма матери кадмием [1].

При обработке ЭМП с частотами от 5 до 30 Гц растворов ДНК в присутствии ионов кадмия наблюдается более значительное – в 2-2,3 раза увеличение интенсивности флуоресценции (рис. 4). Это подтверждает предположение о встраивании ионов кадмия в двойную спираль, что приводит к увеличению интенсивности свечения флуорофоров молекулы ДНК. Стабилизация двойной спирали ДНК с помощью ионов кадмия может быть использована в одном из направлений бионанотехнологий, а именно, в области нанотехнологий нуклеиновых кислот [15], в том числе в качестве молекулярных проводов и при создании новых типов молекулярных устройств на основе биополимеров [8].

Рис. 4  Интенсивность флуоресценции (I_max1 и I_max2) водного раствора ДНК (2,5 мкг/мл)  в присутствии ионов кадмия (II) с концентрацией 0,5 мкг/мл, обработанного ЭМП с частотами от 5 до 30 Гц, время обработки 10 мин,  λ_возб =320 нм, t =22 ^оС (n = 10, р = 0,95, t_0,95 = 1,96).

Были сняты спектры собственной флуоресценции HSA в присутствии различных количеств кадмия в растворе при физиологическом значении pH 7,4, выше изоэлектрической точки альбумина (pI = 4,7) и длине волны возбуждения 295 нм. Спектры флуоресценции представлены на рис. 5. Видно, что при концентрациях кадмия в растворе, меньших или равных концентрациям HSA, происходит незначительное уменьшение интенсивности флуоресценции HSA, что, по-видимому, связано с некоторой дестабилизацией третичной структуры белка, поскольку глобула альбумина лабильна и чувствительна даже к слабым влияниям [20]. Возможны и процессы тушения флуоресценции триптофана соседними группами, в результате конформационного изменения HSA под влиянием катионов Cd²⁺.

В нативном HSA в водных растворах его собственная флуоресценция, обусловленная аминокислотным остатком триптофана Трп-214, который находится в центре связывания I [5], наблюдается при значении длины волны экстинции от 280 до 295 нм и при значении длины волны эмиссии  350±3 нм [6, 7, 16]. В диапазоне pH 6,0 – 8,0 конформационные переходы альбумина сопровождаются изменением микроокружения аминокислотных остатков триптофана, тирозина, гистидина и происходит N – B-переход молекулы, в результате которого повышается  доступность имидазольных остатков, скрытых в N-форме, при этом размеры самой глобулы почти не изменяются [20]. Катионы Cd²⁺ могут взаимодействовать с доступными имидазольными остатками в молекуле HSA.

Рис.5 Спектры собственной флуоресценции человеческого сывороточного альбумина (5 мкМ) при изменении концентрации Cd²⁺ в водном растворе (мг/мл): 0 (1), 0,01 (2), 0,05 (3), 0,25 (4), 0,5 (5). λ_возб =295 нм, t =22 ^оС, pH 7,4.

При дальнейшем увеличении концентрации кадмия в растворе до соотношения [Cd²⁺]/[HSA] = 2:1 интенсивность флуоресценции увеличивается (рис. 5). При попадании в неполярное окружение интенсивность флуоресценции триптофанового остатка в HSA увеличивается, такие локальные гидрофобные взаимодействия стабилизируют вторичную структуру белка. Значительным структурным изменениям молекулы альбумина при концентрациях кадмия в растворе,  соизмеримых с концентрацией HSA, по-видимому, препятствует также система труднодоступных S-S-связей, расположенных регулярно по всей длине полипептидной цепи [5]. Гибкость молекулы HSA, чрезвычайная конформационная лабильность и способность молекулы к скручиванию и раскручиванию (folding/unfolding), создает предпосылки для реализации аллостерических влияний со стороны ионов кадмия на состояние центра связывания I и в целом на связывание лигандов и лекарственных веществ с белком.

Заключение

На основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что в исследуемом диапазоне концентраций ионов кадмия в растворе происходят структурные изменения молекул ДНК, приводящие к увеличению интенсивности флуоресценции азотистых оснований, входящих в состав ДНК. Разгорание флуоресценции водных растворов ДНК в присутствии катионов кадмия, и особенно при обработке таких растворов ЭМП низкой частоты обусловлено высоким сродством токсичного металла кадмия к молекуле ДНК и встраиванием его в двойную спираль. Это подтверждает факт антагонизма эссенциального микроэлемента цинка и кадмия на уровне обмена нуклеиновых кислот. С другой стороны  данное свойство можно использовать при создании новых типов молекулярных устройств в бионанотехнологии.

В ходе проведенных исследований не было выявлено влияние катионов Cd²⁺ на характеристики собственной триптофановой флуоресценции человеческого сывороточного альбумина при их малых концентрациях в растворе на уровне ПДК в крови человека. При увеличении концентраций катионов кадмия в растворе HSA до уровня 10² ПДК наблюдаются функциональные переходы HSA в пределах его нативной структуры, при этом не происходит его денатурации. Деформация молекулярной структуры HSA при не очень больших концентрациях кадмия в растворе может локализоваться именно в неплотно упакованных участках, не приводя к полному разрушению структуры белка.

Работа выполнена при финансовой поддержке  гранта РФФИ р_а № 16-42-230187